糖尿病足属于糖尿病过程中的一种并发症，其主要发病因素是由于糖尿病患者最先发生糖尿病周围神经病变和糖尿病周围血管病变等疾病，从而导致糖尿病患者足部组织的溃疡甚至坏死，临床症状主要表现为患者肢体麻木、疼痛、感觉异常等 [1] 。糖尿病足具有极高的致残率和致死率，常导致患者截肢，目前糖尿病患者中约 25% 以上出现了糖尿病足及其相关疾病 [2] 。

按照中医学辨证论治理论，根据糖尿病足的各时期的临床症状，可归属于痹证（血痹、脉痹）、痛证、疮疡等范畴，发病多因饮食不节，膏粱厚味损伤脾胃，湿浊内生，痰凝经脉；或因气虚血瘀，经脉痹阻，气血不达四末，而致脉痹，病久肝肾亏虚，阴精消灼，致筋炼骨枯而成脱疽，在局部组织溃坏后易感外邪，从而导致创面难以愈合 [3-6] 。因此中医治疗常以活血化瘀和通脉止痛作为糖尿病足的主要治疗方向。

糖痹外洗方由乳香、没药、辣椒、花椒、红花、忍冬藤、冰片 7 味中药组成，具有活血化瘀、通络止痛等功效，能起到针对性治疗糖尿病足以及相关疾病中痹症、血痹、脉痹、痛证、疮疡的效果，临床上已将糖痹外洗方作为治疗糖尿病足的常用复方，具有很好的疗效 [7-8] 。但目前对于其物质基础及作用机制尚不明确。本研究立足于网络药理学方法 [9] ，结合 GEO 数据库进行基因芯片分析，对糖痹外洗方治疗糖尿病足的物质基础和作用机制进行初步探究，为后续深入研究糖痹外洗方治疗糖尿病足的靶点及通路提供新的依据和思路。

1材料与方法

1.1糖痹外洗方活性成分收集及靶点筛选

采用中药系统药理学数据库和分析平台 [10] （ TCMSP ， https://tcmsp-e.com/ ），以“乳香”“没药”“辣椒”“花椒”“红花”“冰片”作为检索关键词进行检索。对于 TCMSP 数据库未收载的中药忍冬藤则采用中医药整合药理学研究平台 [11] （ TCMIP ， http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/home/）、中医药研究综合数据库[12] （ TCMID ， http://47.100.169. 139:8000/tcmid/search/ ）、本草组鉴数据库 [13] （ HERB ， http://herb.ac.cn/ ）查找其中所含化学成分，将忍冬藤查找到的化学成分在 TCMSP 数据库中检索，以获得其对应的 MOL ID 和化合物详细信息。根据 Lipinski 的药物分子类药性“五规则” [14] ，对检索到的各味药中化合物进行筛选，由于糖痹外洗方为外用药，可以忽略其口服利用度（ OB ）等因素的影响，因此采取药物类药性（ DL ）≥ 0.18 ，脂水分配系数 lgP ＜ 0.5 ，得到糖痹外洗方中 7 味中药的候选活性成分。

1.2糖痹外洗方活性成分靶点筛选及网络构建

在 TCMSP 、 TCMIP 、 TCMID 和 HERB 等数据库中预测候选活性成分的靶点，同时结合 UniProt 数据库 [15] （ https://www.uniprot.org/ ）对得到的靶点进行校正，得到对应的标准靶点基因名称。将没有对应靶点的候选活性成分去除，最后得到糖痹外洗方活性成分及对应靶点信息。利用 Cytoscape 3.7.2 软件 [16] 导入糖痹外洗方单味中药名、候选活性成分、作用靶点信息，以此构建糖痹外洗方药物 – 成分 – 靶点的网络图，同时利用 Cytoscape 3.7.2 工具中的 Network Analyzer 插件对所有信息进行拓扑分析，从而根据度（ degree ）值的大小判别出网络中的重要化合物。

1.3GEO数据库糖尿病足相关差异基因表达及靶点筛选

以“ diabetic foot ulcer ”“ diabetic peripheral neuropathy ”“ diabetic peripheral vascular disease ”等与糖尿病足发生发展密切相关的疾病作为为关键词，在 GEO 数据库 [17] 中检索与其相关的基因芯片实验信息。并与 HOME for Researchers 平台 [18] 对所查找到的基因芯片统一进行 log2 化处理。将从 GEO 数据库中筛选后得到的各芯片实验的差异靶点进行合并，全部导入 EXCEL 表格中并删除重复靶标，从而得到糖尿病足以及其相关疾病的主要靶点。将复方的活性成分靶点与糖尿病足的相关靶点导入微生信（ http://www.bioinformatics.com.cn/ ）在线作图平台取交集，获得糖痹外洗方与糖尿病足的共同靶点。

1.4蛋白互相作用（PPI）网络构建

将糖痹外洗方治疗糖尿病足的靶点导入 String 11.5 数据库 [19] （ https://www.string-db.org/ ）中，选择 medium confidence （ 0.400 ）作为最小互作分数，对其进行 PPI 网络分析，删除孤立的蛋白，得到 PPI 数据并保存为 TSV 格式文件。将该网络导入 Cytoscape 3.7.2 中，利用 Cytoscape 3.7.2 软件构建 PPI 网络进行可视化，并重新构建核心靶点的 PPI 网络图。

1.5共有基因基因本体（GO）富集分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

为了进一步探究糖痹外洗方治疗糖尿病足中参与的生物学过程、涉及的分子功能、成分以及信号通路等，将复方与疾病的交集靶点上传至 Metascape 在线 GO 分析平台 [20] （ http://metascape. org/ ），采用 Metascape 对糖痹外洗方治疗糖尿病足的作用靶点进行分析。将上述靶点导入分析平台后，在输入物种和分析物种 2 个选项中选择“ H. sapiens (2) ”进行分析。最后得到 GO 富集分析、 KEGG 通路分析的结果，根据 lgP 值大小及靶点数目的多少对结果进行排序，设定 P ＜ 0.01 ，从中筛选出排名前 20 位的生物学过程和信号通路。同时，根据所属通路将各靶点进行归类，将信息导入 Cytoscape 3.7.2 软件中进行可视化处理，构建“通路 – 靶点”网络图。

1.6分子对接

通过分子对接对活性化合物和关键靶点的结合能力进行验证。分子对接程序采用 AutoDock Vina[21] ，对接方式选择半柔性对接。各靶点的蛋白质晶体结构从 ProteinData Bank （ PDB ）数据库 [22] （ http://www1.rcsb.org/ ）下载，利用 Discovery Studio 4.5 Client 将各蛋白的原配体与其蛋白分离，去除水分子后分开保存，使用 AutoDockTools 为各蛋白质结构加氢，保存为 PDBQT 格式用于下一步对接。从 TCMSP 数据库下载用于对接的化合物结构，对接前使用 AutoDockTools 对蛋白质结构和预对接的化合物进行前处理，随后使用 AutoDock Vina 对接。统计各个化合物与蛋白最佳对接结果的结合自由能，并用 Discovery Studio 4.5 Client 对结合自由能低的对接结果进行可视化。

2结果

2.1糖痹外洗方活性成分及靶点筛选结果

共得到乳香有效成分 5 个，没药有效成分 37 个，辣椒有效成分 8 个，红花有效成分 35 个，花椒有效成分 6 个，忍冬藤有效成分 6 个，冰片有效成分 4 个，其中槲皮素为没药、红花、花椒 3 味中药的共有成分，共计有效成分 99 个。利用 UniProt 数据库将所有活性成分的蛋白名称转化为基因名称，得到乳香靶点基因 150 个、没药靶点基因 182 个、辣椒靶点基因 55 个、红花靶点基因 229 个、花椒靶点基因 145 个、忍冬藤靶点基因 29 个、冰片靶点基因 51 个，对靶点基因整合去除重复值，得到活性成分对应的靶点基因 427 个，结果见表 1 、图 1 。

2.2GEO数据库筛选糖尿病足差异基因表达结果

共查找到 4 个相关的基因芯片实验，分别为 GSE24290 、 GSE43950 、 GSE68183 、 GSE80178 ，各芯片实验差异基因表达结果如图 1 所示。将从 GEO 数据库中筛选得到的各芯片实验的差异靶点进行合并，全部导入 Excel 表格中并删除重复靶标，从而得到糖尿病足及其相关疾病主要靶点共 2 217 个。将复方的活性成分靶点与糖尿病足的相关靶点在线作图平台取交集，获得糖痹外洗方与糖尿病足的共同靶点 64 个，见图 2 。

2.3糖痹外洗方足与糖尿病足交集靶点PPI网络

将上述糖痹外洗方治疗糖尿病足的64个靶点导入String数据库，对糖痹外洗方治疗糖尿病足的潜在作用靶点进行PPI分析，将置信度设置为＞0.400，剔除孤立的靶点蛋白，获取蛋白互作信息；导入Cytoscape 3.7.2软件中进行可视化处理及网络拓扑学分析，得到糖痹外洗方治疗糖尿病足的相关靶点的PPI，该网络由59个节点、256条边组成，见图3。根据PPI网络图可知，核心靶点主要有肿瘤蛋白P53（TP53）、表皮生长因子受体（EGFR）、趋化因子8（CXCL8）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、环加氧酶2（PTGS2）、E1A结合蛋白P300（EP300）、细胞周期素D1（CCND1）基因。

2.4GO富集分析结果

使用Matescape平台对筛选出的64个交集靶点进行GO分析，得到665个生物过程（BP）、30个细胞组分（CC）、80个分子功能（MF）。以Benjamini校正法和P＜0.01作为筛选条件，筛选出排名前20的条目进行可视化分析，见图4。

GO富集结果表明，糖痹外洗方治疗糖尿病足的主要BP包括激素反应（response to hormone）、对细胞外刺激的反应（response to extracellular stimulus）、多肽反应（response to peptide）、对类固醇激素的反应（response to steroid hormone）、对糖皮质激素的反应（response to glococorticoid）。主要CC包括转录调节复合物（transcription regulator complex）、受体复合物（receptor complex）、核被膜（nuclear envelope）、膜微区（membrane microdomain）、脂筏（membrane raft），主要MF包括转录因子结合（transcription factor binding）、DNA-结合转录因子结合（DNA-binding transcription factor binding）、RNA特异性聚合酶IIDNA-结合转录因子结合（RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding）、染色质结合（chromatin binding）、脂结合（lipid binding）。

2.5KEGG通路富集分析结果

使用 Matescape 平台对筛选出的 64 个交集靶点进行分析，得到 KEGG 通路富集分析共得到 100 条通路信息。以 Benjamini 校正法及 P ＜ 0.01 作为筛选条件，筛选出排名前 20 的条目进行可视化分析，见图 5 。同时，根据所属通路将各靶点进行归类，将信息导入 Cytoscape 3.7.2 软件中进行可视化处理，并构建“通路 – 靶点”网络图，见图 6 。

KEGG 通路富集分析结果表明，糖痹外洗方治疗糖尿病足的主要作用通路包括：癌症通路（ pathways in cancer ）、脂质与动脉粥样硬化通路（ lipid and atherosclerosis ）、 Janus 激酶 - 信号传导及转录激活因子 1 信号通路（ JAK-STAT signaling pathway ）、磷脂酰肌醇 -3- 羟激酶（ PI3K ） - 蛋白激酶 B （ Akt ）信号通路（ PI3K-Akt signaling pathway ）、糖尿病并发症晚期糖基化终末产物 /AGEs 受体（ AGE-RAGE ）信号通路（ AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications ）、 p53 信号通路（ p53 signaling pathway ）、核因子 -κB （ NF-κB ）通路（ NF-kappa B signaling pathway ）、 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂抵抗通路（ EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance ）等。其中脂质与动脉粥样硬化通路和 JAK-STAT 信号通路详细信息见图 7 。

2.6分子对接结果

由 PPI 网络及通路分析结果可以看出， EGFR 、 PPARG 、 PTGS2 、 JAK2 、 MMP1 等属于不同类型或通路的靶点在糖痹外洗方治疗糖尿病足的过程中扮演着重要的作用，因此，选取以上几个蛋白作为分子对接目标靶点。根据化合物的度值选取靠前的 10 个主要化合物，包括槲皮素（ quercetin ）、大豆苷元（ daidzein ）、辣椒碱（ capsaicin ）、山柰酚（ kaempferol ）、木犀草素（ luteolin ）、杨梅素（ myricetin ）、积雪草酸（ asiatic acid ）、鞣花酸（ ellagic acid ）、松柏苷（ coniferin ）、地奥司明（ diosmin ），分别与 EGFR （ PDB ID:4HJO ）、 JAK2 （ PDB ID:5AEP ）、 MMP1 （ PDB ID:1HFC ）、 PPARG （ PDB ID:7AWC ）、 PTGS2 （ PDB ID:5IKT ）进行分子对接验证，以 PDB 官网下载文件中各靶点蛋白自带配 体作为对照。目前普遍认为，化合物与蛋白结合自由能越低，说明二者之间结合越稳定，而结合能 ＜ − 5.0 kcal/mol （ 1 cal ＝ 4.4 J ）表明化合物与靶点结合情况较好 [23] ，因此使用结合自由能大小来预测各化合物与蛋白作用情况，各化合物与蛋白对接后结合自由能结果见图 8 。使用 Discovery Studio 2016 Client 对靶点与化合物对接结合自由能低的结果进行可视化，见图 9 。

3讨论

本研究以网络药理学为基础，在 TCMSP 、 TCMIP 、 TCMID 、 HERB 等数据库中检索并得到糖痹外洗方的活性成分和对应靶点，结合 GEO 数据库对糖尿病相关基因芯片实验结果进行总结，得到 4 个与糖尿病足相关疾病基因芯片实验中的差异表达基因，将化合物对应靶点和疾病靶点取交集，最终得到复方治疗糖尿病足的相关靶点，对交集靶点进行 PPI 分析，初步得到了糖痹外洗方治疗糖尿病足过程中的主要物质基础和可能的分子机制，并通过对糖痹外洗方和糖尿病足的交集靶点进行 GO 富集分析和 KEGG 通路分析，得到其治疗过程中可能 涉及的 BP 、 CC 、 MF 、作用通路等信息。根据 KEGG 通路分析结果可知，糖痹外洗方主要作用于脂质与动脉粥样硬化通路、 JAK-STAT 信号通路、 PI3K-Akt 信号通路、糖尿病并发症 AGE-RAGE 信号通路、 NF-κB 通路等。

持续高血糖会导致糖尿病患者体内多种蛋白质非酶糖基化从而形成晚期糖基化终末产物（AGEs），AGEs属于AGE-RAGE信号通路中的核心因子，它的产生会激活AGE-RAGE信号通路[24]，并进一步激活NF-κB、血管内皮生长因子（VEGF）等信号通路，进而引起大量炎症因子和活性氧（ROS）的释放、血管通透性的增加，造成糖尿病足创面形成和难愈[25]，而机体中活性氧的增加会激活JAK-STAT信号通路，可以在一定程度上降低炎症反应及氧化应激所导致的下肢神经炎症和损伤[26]。有研究证明，PI3K-Akt信号通路是影响胰岛素信号通路中最重要的一条[27]，其可以通过抗胰岛B细胞凋亡、促进胰岛B细胞增殖以及减轻胰岛素抵抗等一系列作用发挥其调控胰岛B细胞的作用[28-29]。而在糖尿病足的发展进程中，首先会出现糖尿病下肢血管病变，其发生的机制与炎症反应、血管内皮功能紊乱及胰岛素抵抗等密切相关，在一定程度上属于糖尿病合并下肢动脉粥样硬化的范畴[30]，因此，动脉粥样硬化所导致的动脉硬化狭窄、闭塞，下肢缺血缺氧，在糖尿病足的发生发展中起着至关重要的作用。

本实验从糖痹外洗方7味中药中选取不同类型的代表性核心化合物10个，以及5个在疾病发生发展中起着关键作用的靶点蛋白，其中核心候选活性成分包括槲皮素、大豆苷元、辣椒碱、山柰酚、木犀草素、杨梅素、积雪草酸、鞣花酸、松柏苷、地奥司明，其可能主要作用于EGFR、PPARG、PTGS2、JAK2、MMP1等靶点。为了进一步探究各化合物与靶点作用情况，将此10个化合物分别与5个靶点蛋白进行分子对接初步验证，结果显示，除积雪草酸外，其它9个核心化合物与靶点蛋白对接后的结合自由能＜−5.0 kcal/mol，说明各化合物与靶点蛋白之间有较好的结合能力，而积雪草酸与PPARG和MMP1对接后的结合结果较差，推测可能是由于PPARG和MMP1活性空腔较小，而积雪草酸分子量较大，对接时位阻较大所致。从对接结果可以看出，地奥司明、鞣花酸、木犀草素、杨梅素、槲皮素等与EGFR、JAK2、MMP1对接后的结合自由能甚至等于或低于2个靶点蛋白原有的自带配体，说明地奥司明、鞣花酸、木犀草素、杨梅素和槲皮素等可能对于糖尿病足有着很好的治疗潜力，推测其主要作用于EGFR、JAK2、MMP1等相关的通路和靶点发挥作用。此外，10个核心化合物中，辣椒碱与PPARG的结合自由能最低，地奥司明与PTGS2的结合自由能最低，推测辣椒碱和地奥司明能够通过分别作用于与PPARG和PTGS2相关的通路和靶点发挥治疗糖尿病足的作用。

地奥司明常被用于增强静脉张力和血管保护，可以降低静脉血管血瘀滞，目前临床已有报道将地奥司明用于治疗糖尿病足，证明其能够有效改善患者下肢水肿的症状，提高足部创口愈合率[31]，作用机制是减少机体中糖基化产物AGEs的产生[32]、激活JAK-STAT信号通路从而发挥抗炎抗氧化以及保护胰岛B细胞的作用[33-34]。鞣花酸为天然多酚二内酯类化合物，具有很强的抗炎抗氧化作用[35]，有研究表明，其能够通过抑制炎症反应起到保护胰腺的作用[36]。在糖尿病微血管病变中，木犀草素能够通过增强超氧化物歧化酶（SOD）的活性，从而起到抗氧化的作用[37]。而杨梅素可以通过诱导胰岛素的分泌、缓解高血糖导致的体内氧化等而具有显著的降血糖作用，还可以降低一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6等炎症因子[38]，抑制TNF-α诱导的血管内皮生长因子VEGF表达和皮肤组织中MMP-9的表达，从而发挥抗炎、预防皮肤和血管损伤的作用[39]。槲皮素为黄酮醇类化合物，对于氧化应激导致的神经损伤、细菌感染、炎症反应具有良好的治疗效果[40-42]，最近有研究发现，槲皮素还可通过保护胰岛β细胞从而改善糖尿病大鼠的糖代谢水平[43]。

综上所述，本研究以网络药理学为基础，筛选出糖痹外洗方治疗糖尿病足的核心药效成分。糖痹外洗方中各成分主要通过降低血糖、抗炎、抗氧化、降低血瘀、促进血管生成和皮肤愈合等相关靶点及通路发挥作用，充分体现了复方多成分、多靶点的特点，其报道出的良好活性也与分子对接中所得出的结果相佐证，证明本研究网络药理学结果的可行性。本次结果得出的核心活性成分中也有许多尚未用于糖尿病足相关疾病的研究，后续可以在各化合物治疗糖尿病足方面进行更加深入具体的研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：宁遵锡，刘鹏宇，杨宇，魏秀岩，高慧媛．基于网络药理学结合GEO数据库多芯片分析法探讨糖痹外洗方治疗糖尿病足的作用机制 [J]. 现代药物与临床, 2022, 37(9): 1975-1986 .

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